木棉褐斑病病原菌鉴定及生物学特性
实习基地中发病的木棉植株。
1.1.2供试药品
葡萄糖、谷氨酸、KH2PO4、NaOH、甘露醇、NH4NO3、KNO3、KCl、蔗糖、MgSO4、脲、Ca（NO3）2、NaNO3、盐酸、Fe2（SO4）3、可溶性淀粉均为分析纯，广州化学试剂厂生产；麦芽糖、琼脂粉、α-乳糖均为生化试剂，国药集团化学试剂有限公司生产。
1.2试验方法
1.2.1木棉褐斑病症状描述
通过基地观察木棉褐斑病的典型症状，记录其发病特点，并对典型症状进行拍照。
1.2.2木棉褐斑病病原分离及致病性测定
取基地发病木棉叶片带回實验室后，采用常规组织分离法进行分离[8]。分离时取病健交界处的叶片组织，接种到PDA培养基上，置于生化培养箱中25 ℃培养5 d，期间取样进行镜检。然后挑取较纯菌落，进行纯化处理，并对纯化后的菌落、菌丝体、病原孢子等进行形态描述和显微拍照。根据柯赫氏法则操作步骤，采用针刺法接种菌饼的方式对温室盆栽苗进行致病性测定[9]，处理时以接种不带菌的培养基作为空白对照，观察记录，5 d后对接种发病叶片再次进行分离病原。
1.2.3木棉褐斑病病原鉴定
将纯化病原菌用PDA培养基于25 ℃下培养产孢后，制作临时玻片进行显微观察。根据菌落特征，菌丝形态，分生孢子大小、形态及颜色等相关特征。查阅相关文献进行比对后，确定病原菌的分类地位[10-15]。
1.2.4木棉褐斑病病原菌生物学特性研究
1.2.4.1不同温度对菌丝生长的影响在生长良好菌落边缘，用直径5 mm打孔器打取菌丝块，接种于PDA培养基上，置于5、10、15、20、25、28、30、32、35、40 ℃ 10个不同温度中进行培养，培养7 d后用十字交叉法测量个菌落直径，每个处理重复5次。
1.2.4.2不同pH值对菌丝生长的影响在无菌条件下，用灭菌的0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH溶液，将经过灭菌的培养基pH值分别调节至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0等8个梯度。经接种病原菌（直径5 mm）后，置于25 ℃中进行培养，7 d后用十字交叉法测量菌落直径，每个处理重复5次。
1.2.4.3不同碳源对菌丝生长的影响以Czapek培养基为基础培养基，用等量α-乳糖、麦芽糖、葡萄糖、D-甘露糖和可溶性淀粉分别替代Czapek培养基中蔗糖作为碳源，配制不同碳源的培养基。然后接种病原菌（直径5 mm）于不同碳源的培养基上，25 ℃培养7 d后用十字交叉法测量菌落直径，每个处理重复5次。
1.2.4.4不同氮源对菌丝生长的影响以Czapek培养基为基础培养基，用等量的NaNO3、Ca（NO3）2、谷氨酸、酵母膏、脲和NH4NO3分别替代Czapek培养基中KNO3作为氮源，配制不同氮源的培养基。然后接种病原菌（直径5 mm）于不同氮源的培养基上，25 ℃培养7 d后用十字交叉法测量菌落直径，每个处理重复5次。
1.2.4.5不同光照条件对菌丝生长的影响在PDA培养基上接种纯化病原菌（直径5 mm）后，分别置于全黑暗处理、全光照处理、光暗交替（光—暗周期12 h—12 h）3种光照环境中25 ℃培养7 d后用十字交叉法测量菌落直径，每个处理重复5次。
1.2.5数据统计分析
用Excel统计软件计算菌丝生长抑制率，采用SPSS 19.0软件进行分析各重复处理间的方差值和不同处理间的显著性检验。
2结果与分析
2.1木棉褐斑病危害症状
木棉褐斑病主要危害木棉叶片及茎秆，叶片发病初期，被侵染叶片首先表现为暗褐色小点（图1-A），后期病斑逐渐扩大为圆形、梨形甚至椭圆形的不规则病斑，病斑边缘褐色至暗褐色，中间褐色，病健交界处带有明显黄色晕圈（图1-B）；发病严重时，中央组织坏死变脆或穿孔，或多个病斑联合成块，中间灰褐色腐烂，湿度大时，叶片表面出现橘黄色水珠（图1-C）。茎秆初侵染表现为褐色小点，之后病斑逐渐扩大，成椭圆形分布在表面，呈褐色或黑色。发病严重时，中央组织变黑，周围病斑联合在一起。
2.2木棉褐斑病病原菌致病性测定
在木棉发病叶片上，初次分离共得到炭疽菌（Bacillus spp.）、链格孢菌（Alternaria spp.）、弯孢霉菌（Curvularia spp.）、镰刀菌（Fusarium spp.）、多主棒孢霉（Corynespora cassiicola）和2种未知菌等7種病原菌。采用温室盆栽苗菌饼接种方法，对分离得到的病原菌进行致病性测定。结果表明，盆栽木棉叶片在接种3 d后，可看见接种部位出现褐色小病斑，并伴有扩散趋势（图2-A）。连续观察10 d后，接种叶片病斑扩大，病健交界处出现明显黄色晕圈，并伴有叶片掉落现象。而用不带菌的空白培养基接种后仅出现针刺的机械损伤，呈现黑色小点，连续观察10 d，接种部位无明显扩展（图2-B）。对显症部位再次进行取样分离，所得到的病原菌与接种病原一致。接种试验表明，分离的病原菌是木棉褐斑病的致病菌。
2.3木棉褐斑病病原菌形态学鉴定
通过对病原菌培养菌落形态、菌丝体特征、分生孢子梗和分生孢子形态进行显微观察，并查阅相关病原真菌形态描述和分类文献资料，初步确认，引起木棉褐斑病的致病菌为半知菌亚门（Deuteromycotina）、丝孢纲（Hyphomycetes）、丝孢目（Hyphomycetales）、暗色菌科（Dematiaceae）、棒孢属（Corynespora）的多主棒孢霉（Corynespora cassiicola）。
该病原菌在PDA培养基上，菌落呈辐射状向四周平展生长，菌落舒展，边缘规则，绒毛细发状，菌落培养初期颜色较浅，呈灰白色，后期逐渐变为灰褐色；菌丝体半透明、具分枝情况，初期无色，后期淡褐色。PDA培养基上培养的分生孢子梗直、细、长、稍弯或屈膝状，垂直着生于菌丝顶端，单生或分枝。分生孢子梗产孢处膨大，浅褐色至褐色。分生孢子孔出、单生或顶生，经分离培养后变长。传代培养2～3次后形态稳定，基部膨大，顶端钝圆，中后部分细长直或稍弯，多数呈棍棒状，平均大小38.92 μm×8.35 μm，光滑成熟分生孢子3～5个隔膜。
2.4木棉褐斑病病原菌生物学特性
2.4.1温度环境对病原菌菌丝生长的影响
温度对病原菌菌丝生长的影响见表1，病原菌菌丝在5～40 ℃不同温度条件下均可生长，但低温和高温生长较为缓慢，而最适生长温度为28 ℃，连续培养7 d后，菌落直径平均值为68.8 mm，菌丝生长速率为9.8 mm/d。
2.4.2不同pH值对病原菌菌丝生长影响
从表2可以看出，病原菌菌丝在pH值为4.0～11.0范围内的不同酸碱环境条件下均可生长，但pH值在5.0～9.0之间生长比较良好，其中pH值为6时，菌落平均直径达62.80 mm。总体来说，在偏碱性条件下生长比较缓慢，微酸性条件下有利于菌丝生长。
2.4.3不同碳源、氮源对病原菌菌丝生长的影响
测定结果表明，多主棒孢霉病原菌在所选择的5种碳源和氮源配制的培养基中均能正常生长，但不同碳源、氮源对病原菌菌丝生长的差异较为明显。从表3可以看出，所选择的5种碳源以麦芽糖比较适合菌丝的生长，培养5 d菌落直径达86.60 mm，其生长速率为12.37 mm/d，其次是D-甘露糖，可溶性淀粉作为碳源的生长最慢，生长速率仅为7.68 mm/d。氮源病原菌最适生长氮源为硝酸钠，其生长速率为8.71 mm/d，其次是硝酸钙，以硝酸铵生长最慢。
2.4.4光照对病原菌生长的影响
通过连续培养7 d后，发现不同光照下病原菌菌丝的生长无明显差异，无论是在连续黑暗还是在连续光照等条件下，其菌丝菌落直径和菌落生长速率基本一致。平均生长速率值分别为13.0 mm/d和 12.8 mm/d，不同处理间差异不显著。
3结论与讨论
本试验通过对木棉叶片上的发病部位经病原菌分离纯化、致病性测定和形态特征观察，确定引起木棉褐斑病的病原菌是多主棒孢霉菌Corynespora cassiicola。该菌在自然条件下可寄生于多种植物的种子、枯死部位或土壤中，其寄主范围广泛，可以侵染烟草、黄瓜、番茄、木瓜、香蕉、广藿香和一串红等多种植物，引起植株叶片褪绿、坏死等症状[16-21]。多主棒孢霉菌过去作为一种次要病害未引起相应关注，自北美热带地区暴发番茄棒孢霉叶斑病和橡胶棒孢霉叶斑病以来，近年来在我国已由次要病害上升为主要病害，而且危害程度日益严重[22]。木棉叶斑类的病害较多，危害较为严重的有炭疽病、拟盘多毛孢叶斑病、黑痣病和叶点霉圆斑病等，高拓等在云南红河所分离的致病菌为尾孢属真菌，其病原主要危害叶片，并未发现有危害树干的情况[23]，而本试验中所分离的多主棒孢霉病原菌，在后期进行危害调查时发现，该病原菌除危害木棉叶片外，还可危害木棉树干，造成树干发病部位坏死。
目前，国内学者对不同作物上的多主棒孢菌株进行了基础生物学特性研究。不同作物上多主棒孢菌株的生物学特性有所不同。对该菌的相关生物学特性研究表明，多主棒孢的分生孢子可借风、雨或农事操作在田间传播，远距离的传播以种子传播为主，而且休眠菌丝可以在种子表皮或种皮内潜伏，成为后期危害的初侵染源。在菌落生长研究中，众多研究表明，该菌菌丝生长最适温度为28 ℃，产孢最适温度为30 ℃，而萌发温度为15～35 ℃，萌发对湿度要求较高，相对湿度达90%以上才能萌发，水滴中萌发率最高[24-26]，因此，高温、高湿条件有利于棒孢叶斑病的流行和蔓延。通过平行比较发现，张贺对巴西橡胶树棒孢落叶病的研究结果[24]与本结果基本一致，在微酸至中性环境中生长较好，但与罗霓等从番木瓜和木薯上所分离的多主棒孢霉测定结果[27-28]差异较大，原因可能是不同寄主植物上的生理小种之间的差异。由于供试碳、氮源与培养条件的不同，导致对碳源和氮源的利用之间也会有所差异。
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