芒果核苷二磷酸激酶（NDPK）基因克隆及表达分析
组织中均有表达，以叶片中表达最高，其次是花和果皮；在芒果进入生殖时期的花芽分化期表达量最高，此后在芒果果实发育进程中逐渐降低并趋于平稳。结合病害处理转录组样本中的差异性表达结果，推测芒果MiNDPK1基因在花芽分化进程、抗病性诱导及免疫应答通路上发挥重要作用。
关键词 芒果；核苷二磷酸激酶；基因克隆；生物信息学分析；表达分析
中图分类号 S667.7 文献标识码 A
核苷二磷酸激酶（Nucleoside diphosphate kinase，NDPK）是一种保守性多功能蛋白，其首要功能是依靠该酶上一保守的组氨酸残基介导催化二磷酸核苷（Nucleoside diphosphate，NDP）和三磷酸核苷（Adenosine triphosphate，ATP）之间的磷酸基团转移反应来维持生命体细胞内ATP和NTP等浓度的平衡[1]，参与UTP和GTP生物合成过程，在生物体新陈代谢方面起重要作用。NDPK蛋白由Berg等[2]于1953年发现以来，主要在人和动物领域研究较为深入，植物中研究较晚，但其普遍存在于原核、真核生物中，并多数以四聚体的形式存在于原核生物中，而在真核生物中却以六聚体形式存在；已有研究结果认为，NDPKs基因是一种古老基因，并以家族的形式存在，定位于细胞溶质、细胞核、线粒体及叶绿体中，是一种分泌蛋白。人类基因组中存在8个NDPKs基因（NDPKH1-NDPKH8），植物中发现的主要有NDPK1-4四个类型（拟南芥、水稻），而支原体等部分微生物不存在NDPKs基因，但多数物种存在至少一种NDPK基因[3]。
随着研究的深入，NDPKs被看作是一种“管家酶”，主要功能是维持NDP和NTP代谢平衡[1]。NDPK以其具有催化磷酸基团转移为基础的功能，在动物中不同细胞环境发挥特异性功能，起着控制细胞增殖、调控转录[4]、蛋白质磷酸转移[5-7]、DNA修复损伤[8]、细胞分化[9]、细胞的移动[10]、糖类和脂类代谢[11-12]等作用；而动物核苷二磷酸激酶家族中的2个重要成员NDPK-A和NDPK-B中的NDPK-A与肿瘤转移的关系更为密切，NDPK-A被认为通过多种作用机制抑制肿瘤转移，在乳腺癌、胰腺癌、肝癌和恶性黑色素瘤等癌症患者癌组织中的表达水平与癌组织的转移潜能呈负相关[13-16]，也用于肿瘤（NDKA）和结直肠癌（CRC）等病症的生物标志物[17]。在植物体上，NDPKs除在植物种子萌发、生长发育[18-19]、內源激素[20]、植物色素A/B[21]和烟草细胞凋亡[22]起调控作用外，还参与如盐害、低温[23]、高温[24]、干旱[25]、机械损伤[26]、热激[27]、紫外光照射[28]、氧化胁迫[29]、金属离子[30]、化学药剂（甲基紫罗碱和脱落酸等）[31-32]、病害[33]等生物与非生物碱胁迫的应答机制。此外，NDPKs也参与细胞信号转导[29，34]、乙烯信号转导[35]、保护防御相关基因的诱导表达[36]及响应光剌激等方面的作用。
芒果（Mangifera indica L.）是中国热带亚热带地区重要的经济作物，是世界第二大热带水果，素有“热带水果之王”的美称。芒果的热带属性导致芒果对逆境胁迫比较敏感，如开花期的低温阴雨天气，容易引起芒果授粉受精不良，座果率降低，也易导致病害的发生促使芒果大量腐烂[37]；干旱、盐等胁迫后易导致芒果果实变小、产量降低，从而影响品质[38]。本试验在芒果炭疽病样本转录组数据库中查找的差异性表达序列，经比对确认该片段为芒果核苷二磷酸激酶（NDPK）基因，根据片段序列设计3′RACE引物，并扩增3′端序列，经拼接比对分析，预测获得含开放阅读框的cDNA序列；进一步设计全长引物，然后PCR扩增获得准确全长基因序列，对其进行生物信息学和不同组织器官的表达模式分析，旨在为进一步探明芒果核苷二磷酸激酶基因的功能作用、调控逆境胁迫及免疫应答通路方面的作用机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
参试芒果品种为贵妃芒，保存于海南省儋州市的农业部儋州芒果种质资源圃。选择生长一致的贵妃芒，采集芒果根、茎、叶、花、果，用于不同组织器官的表达分析；采集芒果从花芽分化期至果实成熟期之间不同时期组织材料，用于芒果果实发育过程中的表达分析。所有采集组织材料液氮速冻并于-80 ℃保存备用。
1.2 方法
1.2.1 RNA提取及cDNA合成 提取芒果RNA，参照天根生化科技有限公司的RNAprep pure Plant Kit说明书进行，采用TAKARA的 3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTM RTase反转录获得3′RACE扩增cDNA模版，采用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成第一链cDNA模板，具体操作参照说明书进行。
1.2.2 NDPK1基因克隆 根据转录组数据序列片段，运用Primer 5设计3′RACE特异引物3′-GSP1、3′-GSP2；以拼接的cDNA序列设计MiNDPK1基因的全长特异引物MiNDPK1-F1、MiNDPK1-R1（表1）。以3′RACE cDNA模板扩增NDPK1基因3′端序列，使用上游外侧特异性引物（3′-GSP1）和3′RACE Outer Primer进行1st PCR反应。如果1st PCR反应未能得到目的产物，再使用上游内侧特异性引物（3′-GSP2）和3′RACE Inner Primer进行2nd PCR反应。 外侧PCR反应体系设置为：cDNA模板2 μL，1×cDNA Dilution Buffer Ⅱ 2 μL，3′RACE Outer Primer和3′-GSP1引物各（10 μm） 2 μL，10×LA PCR Buffer Ⅱ（Mg2+）4 μL，MgCl2（25 mmol/L）3 μL，LA Taq（5 U/μL）0.25 μL，补足水至总体积为50 μL。PCR反应程序为：95 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共25个循环；72 ℃ 10 min；第二轮PCR反应则以第一轮PCR产物稀释50倍后，取2 μL作为模版进行第二轮PCR扩增，除引物更换为内侧引物外，其余体系同第一轮PCR，PCR反应程序同第一轮，但循环数改为30个循环。PCR结束后，取 5～10 μL的PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，确认3′RACE PCR扩增产物，再进行回收纯化，连接到pMD18-T克隆载体上并转化至感受态的DH5α大肠杆菌中，涂板培养，挑取单克隆经菌液PCR验证获得阳性单克隆送往英俊公司测序。