蛋白质组学与心血管疾病
摘要：心血管疾病是目前威胁人类健康和生命的主要病因，其中许多心脏疾病的细胞和分子机制的研究手段相对比较匮乏，而随着人类基因组图谱的绘制完成和蛋白质组学的不断完善，因此，蛋白质组作为基因表达的最终产物，将为揭示疾病发生、发展的转化规律提供有益的思路。本文综述了近年来蛋白质组学应用于心血管疾病的研究进展。
关键词：蛋白质组学；心血管疾病
2000年6月26日，由六国合作研究的人类基因组工作草图基本完成，已给制出人体97%的基因组，基中85%的基因组序列得到了精确测定，包含了人体约30亿个碱基对的正确排序。此后，科技工作者们开始将目光转向蛋白质组学（proteomics）、功能基因组学的研究，研究的重心也从简单地揭示遗传信息转移到外界因素下的生物功能研究，蛋白质组学也由此应运而生。
1 蛋白质组学的定义
蛋白质组（ Proteome）的概念，最早见诸于1995年7月的"Electrophoresis"杂志上，它是指一个有机体的全部蛋白质组成及其活动方式。早期定义为：微生物基因组表达的整套蛋白质，在多细胞微生物中，整套蛋白质指一种组织或细胞表达的蛋白质，后来定义为：一个基因组所表达的蛋白质。
蛋白质组学（Proteomics）是以蛋白质组为研究对象的新的研究领域。它可分为：①表达蛋白质组学（expression proteomics： 即把细胞、组织中的蛋白，建立蛋白定量表达图谱，或扫描EST图。该方法依赖2-D凝胶图和图像分析技术，而且在整个蛋白质组水平上提供了研究细胞通路，以及疾病、药物相互作用和一些生物刺激引起的功能紊乱的可能性；②细胞图谱蛋白质组学（cell-map proteomics）：即确定蛋白质在亚细胞结构中的位置；通过纯化细胞器或用质谱仪鉴定蛋白复合物组成等，来确定蛋白质-蛋白质的相互作用。
2 蛋白质组学在心血管疾病中的应用
心血管疾病严重威胁人类的健康，其发生和发展涉及动态、复杂、精细的细胞内过程。作为细胞的基本功能单位，蛋白质是生命活动的执行者，广泛参与细胞的功能与调节，在病理条件下发生改变，决定细胞、组织和器官的表型[1]。基因表达产物--蛋白质异常是疾病发生发展中的重要因素。目前，蛋白质组学技术已经广泛应用于肿瘤、血液性疾病、自身免疫病等方面的研究，并且取得了一定进展。
2.1蛋白质组学在冠状动脉粥样硬化中的研究应用 冠状动脉粥样硬化样心脏病（coronary heart disease，CHD，简称冠心病）是一种遗传和环境危险因素共同作用而发病的多基因遗传性疾病。CHD的发生主要涉及脂质代谢障碍、血管内皮细胞损伤、单核细胞迁移并分化为巨噬细胞、平滑肌细胞从中膜迁移至内膜并增殖、泡沫细胞的形成、细胞坏死和脂质沉积等许多过程。You SA等[2]将蛋白质组的方法运用于寻找冠状动脉粥样硬化发病的生物标志物的研究。他们发现，冠状动脉病患者的铁蛋白轻链的表达量显著增加。随后的DNA印迹和PCR进一步证实了铁蛋白轻链表达水平的升高，并推测增加的铁蛋白轻链通过氧自由基的产生调节血管壁内脂类的氧化状态，加速冠状动脉病的产生。Buscemi等[3]叫利用二维凝胶电泳技术分离蛋白质，利用分行质谱技术（MALDI-TOF）鉴定Rac1转基因心肌肥厚小鼠模型中肌酸激酶M·链蛋白的变化，结果显示，该种蛋白含量比正常组高，因此，监测肌酸激酶M.链蛋白的变化可以用来诊断心肌肥厚，并判断病情的变化。杨鹏远等[4]分离大鼠冠状动脉总蛋白，检测出2626个蛋白质斑点，并且得到不同条件下的蛋白质组的差异图谱，对比分析了正常组和动脉粥样硬化模型组心肌组织的差异蛋白，发现33个蛋白质斑点只在正常大鼠心肌蛋白检测到表达，46个蛋白点在两种细胞中表达量上有显著差异。
2.2蛋白质组学在扩张型心肌病中的研究应用 扩张型心肌病 （dilated cardiomyopathy，DCM）是心肌疾病的一种类型，其特征为左或右心室或双侧心室扩大，并伴有心肌肥厚。心室收缩功能减退，伴或不伴充血性心力衰竭。室性或房性心律失常多见。病情呈进行性加重，死亡可发生于疾病的任何阶段迄今为止，病因未明，DCM是利用蛋白质组学研究最为深入的一类心血管疾病。研究发现有100多种心肌蛋白质在DCM的心肌细胞中明显减少，这些蛋白质许多已经被鉴定，其中包括细胞骨架蛋白即肌纤维蛋白，与线粒体及能量产生相关蛋白，与应激反应相关蛋白等[5]。Pleissner等[6]的研究发现，DCM患者的52种右心房心肌蛋白的表达水平与正常人相比发生了明显变人，其中肌球蛋白轻链2（Mt，C-2）的蛋白丰度增加到336%，而HSP27降低到59%，这两种蛋白被认为是DCM的右心房的特征性标记蛋白。Weekes等[7]对牛先天性DCM 心肌进行2-DE分析。证实其存在线粒体相关蛋白表达的改变，共35个相关蛋白质点，24种蛋白质表达下降，11种蛋白质丰度增高， 降低的蛋白质包括线粒体和能量代谢表达的蛋白，包括：肌酸激酶M、细胞色素C氧化酶、细胞色素b5、肌红蛋白、3，2-transenoyl-CoA转移酶。
2.3蛋白质组学在心力衰竭中的研究应用 心力衰竭的临床表现有左心室泵血功能降低、射血分数下降、心脏扩大、神经体液反应活化，在细胞水平出现心肌细胞形态和收缩功能的变化。应用双向电泳技术研究其蛋白质组变化，有助于了解心衰时心肌细胞功能障碍及代偿作用的分子机制。Heinke等[8]以右室起搏（245 bpm，34w）诱发犬心力衰竭，取左心室肌组织进行二向电泳和MALDI-MS质谱分析，发现在pH 3～10的范围内分离的蛋白质分子量为10～150 kDa，有31种蛋白质发生明显变化，其中21种数量减少，10种增加。发生变化的蛋白质相对分子量在15～68 kDa之间，等电点为4.6～9.02，有60%的蛋白质等电点大于6.5，目前已鉴定出其中的23种包括：线粒体应激70相关蛋白（属热休克蛋白HPS70家族）数量增加，肌酸激酶M链、羟甲基戊二酰辅酶A合成酶、3，2-transenoyl-CoA转位酶、细胞色素C氧化酶、细胞色素b5数量减少；磷酸甘油酸变位酶、磷酸丙糖异构酶增加，血红蛋白、肌红蛋白均减少，半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystationC减少，Ras相关蛋白增加。以上变化普遍存在于不同种属生物的心衰过程中。
2.4蛋白质组学在心肌缺血/再灌注损伤中的研究应用 心肌缺血/再灌注损伤（ischemia/reperfusion iniury，I/R）包括从轻微缺血时的可逆性损伤到严重缺血时不可逆性细胞坏死。研究该过程中蛋白质组的变化，是理解这一病理过程的基础。目前研究重点主要集中于细胞骨架、肌原纤维、信号转导分子等蛋白组分的改变。Coma等[9]采用免疫组化和Western Blotting方法研究成年豚鼠在常氧、缺血、缺血/再灌注、钙反常等情况下细胞内钙超载对心肌细胞内肌钙蛋白T（TnT）免疫反应性修饰的影响：正常与单纯缺血组呈阴性反应，缺血再灌注和钙反常心肌细胞呈TnT免疫反应阳性。Western Blotting显示，缺血再灌注和钙反常心肌细胞中TnT出现240～260 kDa、65～66 kDa的反应性多肽片段。Arrell等[10]采用腺苷（100/Zmol/L）预处理成年兔心肌细胞，经分步提取蛋白、双向电泳分离后发现，在生理pH条件下提取低丰度胞浆蛋白时可见约800个斑点，有3个条带迁移。酸性条件下提取高丰度肌丝蛋白，银染后可见蛋白多集中于pH 5.0左右。Westem Bloting显示该组蛋白质为磷酸化MLC1（myosin light chain 1），其中腺苷预处理组MLC1中有（34.04～2.7）%发生单磷酸化，（25.74～1.6）%发生双磷酸化，其磷酸化程度高于对照组[（28.94～2.4）%与（5.14～1.0）%，P<0.05，且以单磷酸化形式增多为主。以MALDI（matrix-assisted laser desorption ionization）-TOF（time offlight）鉴定磷酸化的氨基酸残基发现，质量为558.667 Da和790.845 Da的片段出现在未磷酸化的MI.E1图谱中，而在磷酸化样本中明显缺失。
2.5蛋白质组学在心肌细胞线粒体功能中的研究应用 由于心脏做功需要提供足够的能量，心肌细胞内富含大量的线粒体，当线粒体出现病变时，心脏功能会受到影响。Taylor等 用高度纯化的正常人心脏组织的线粒体编辑了线粒体蛋白质组目录。通过双相电泳共产生了615个清晰的蛋白点，将所有蛋白质都标出了pI值、分子量范围和疏水性等特征参数。线粒体膜内的已知氧化磷酸化的蛋白质亚组的覆盖率>90%。不过，其中19%的被鉴定蛋白质的生物化学信息尚未明确。肌酸激酶（CK）对于维持高能磷酸盐内环境稳定至关重要。对CK基因双敲除（DbKO-CK）而缺失MM（muscle mitochondria1）和ScMit（sarcomeric mitochondriM）CK亚型小鼠研究表明，骨骼肌收缩功能严重受损，而心肌功能基本未发生显著变化。通过蛋白质组技术研究发现，MM-和ScMit-CK亚型的缺失并未引起心肌线粒体蛋白质很大程度的变化 。
总之，蛋白质组学是对全套基因组所编码的蛋白质的组成、结构和功能，以及蛋白质之间的相互作用进行整体研究的一门新兴学科。对蛋白质组进行研究的最终目的在于：找到具体的分子靶点，并以此为突破口，最终攻克如心血管疾病这样的人类重大疾病。通过功能蛋白质组学的研究，可能揭示蛋白质修饰究竟是某一疾病的起因还是结果，从而达到诊断和治疗疾病的目的，为我们下一步的医疗卫生事业作出贡献。
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编辑/哈涛