正交设计研究山牡荆总黄酮提取工艺
摘要[目的]建立山牡荆总黄酮的合理提取工艺，为山牡荆的开发及利用提供理论依据。[方法]以乙醇用量、乙醇浓度、提取时间和提取次数等为考察因素，以山牡荆总黄酮含量作为指标，应用正交试验对提取工艺进行优化。[结果]山牡荆中总黄酮的最佳提取工艺为乙醇用量12倍量、乙醇浓度70%乙醇、提取次数3次、每次1 h。[结论]该提取工艺简单、高效，适用于山牡荆的总黄酮提取。
关键词 山牡荆；总黄酮；正交试验；提取工艺
中图分类号S567文献标识码A文章编号0517-6611（2014）23-07748-02
基金项目国家自然科学基金资助项目（31170320）。
作者简介 代现平（1970-），男，河南鹤壁人，副教授，博士，从事天然活性成分研究。
收稿日期20140702牡荆属植物Vitex是马鞭草科乔木或灌木，全世界大约有250余种，主要分布在热带及温带地区。在我国有14种，主要分布于长江以南，在东北、西北、华北等地也有少量分布[1]。山牡荆（Vitex quinata）一般以其树干心材和干燥根入药，具有止咳定喘、清热解毒及镇静退热等功效，常用于痈肿疮疡、温病发热、风湿热痹、关节红肿热痛及热毒血痢等病症[2]。研究显示，山牡荆及牡荆属植物主要含有黄酮类、苯丙素类、甾类、环烯醚萜类、三萜类、二萜类、倍半萜类等化学成分[3-8]。其中黄酮类化合物，因其广泛的生物活性已成为研究的热点。现代药理研究证实，山牡荆的黄酮类成分具有如抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗炎、增强机体免疫力、止咳祛痰等多种药理作用[3-8]。因此，研究山牡荆中总黄酮的提取工艺具有重要意义。笔者以山牡荆总黄酮作为考察指标，采用正交设计试验进行提取工艺的优化，对影响提取的各种条件及因素进行了深入探讨，为山牡荆总黄酮提取工艺的研究及山牡荆总黄酮开发利用提供依据。
1 材料与方法
1.1材料与试剂 山牡荆（烟台绿叶制药，经滨州医学院药学院天然药物实验室鉴定为真品）；对照品芦丁（中国药品生物制品检定所）；其他试剂为分析纯试剂。
1.2仪器 JA5003B电子天平（上海精密仪器仪表有限公司）；SHZⅢ循环水式多用真空泵（巩义市瑞德仪器设备有限公司）；TU190紫外可见分光光度计（北京普析通用）；HH6型恒温水浴锅（上海乔跃电子有限公司）；DHG9053型真空干燥箱（上海精密仪器仪表有限公司）；RE301旋转蒸发仪（巩义市瑞德仪器设备有限公司）。
1.3 方法
1.3.1 供试品溶液制备方法。准确称取山牡荆粗粉30 g，于1 000 ml烧瓶中，按要求加入提取溶剂，加热回流提取一定时间，过滤，减压回收溶剂，干燥，称重，得山牡荆干膏。精密称取在不同提取条件下所得山牡荆干膏10 mg，于10 ml容量瓶中，用60%乙醇溶解，定容后备用。
1.3.2 标准品溶液制备方法。精密称取于120 ℃干燥至恒重芦丁对照品10 mg，于100 ml容量瓶中，加60%乙醇30 ml，水浴微热使溶，放冷，60%乙醇定容至100 ml，制成0.100 mg/ml芦丁对照品溶液。
1.3.3 标准曲线制备。分别精密吸取芦丁对照品溶液0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 ml，分别于25 ml容量瓶中，各加0.75 ml亚硝酸钠溶液（50 mg/ml），摇匀，静置7 min；再加0.75 ml硝酸铝溶液（100 mg/ml），摇匀，静置7 min；再加10 ml氢氧化钠溶液（40 mg/ml），60%乙醇定容，摇匀，静置8 min。于510 nm波长处测吸光度，以吸光度A为纵坐标、芦丁浓度C为横坐标，进行线性回归，计算回归方程。
1.3.4 精密度试验。 精密吸取2.0 ml芦丁对照液于25 ml容量瓶中，按“1.3.3”方法，重复操作5次。
1.3.5 稳定性试验。取适量供试品溶液，按“1.3.3”方法，于0、2、4、6、8 h分别测定吸光度。
1.3.6 重复性试验。取同一批药材，按照“1.3.1”方法制备供试品溶液，并按“1.3.3”所述方法测定吸光度，重复5次。
1.3.7 回收率试验。精密移取6份已知含量供试品溶液各0.5 ml，均精密加入芦丁标准品溶液，按“1.3.3”方法测定其吸光度，计算山牡荆总黄酮含量。
1.3.8 供试品总黄酮含量测定。精密移取5 ml供试品溶液，于25 ml容量瓶中，按“1.3.3”方法测吸光度，并代入回归方程，计算总黄酮的含量。
1.3.9 正交试验。应用正交试验设计，选择了乙醇浓度（A）、乙醇用量（B）、提取次数（C）和提取时间（D）作为考察因素，每个因素选择了3个水平（），以总黄酮含量作为考核指标，按照L9（34）正交设计方案进行试验。
2 结果與分析
2.1 山牡荆中总黄酮的含量测定经计算，以吸光度A为纵坐标、芦丁浓度C为横坐标的标准曲线的回归方程为A=12.473C+0.001 9（r=0.999 6），表明芦丁在0.005～0.049 mg/ml浓度范围与其吸光度呈良好线性关系。精密度试验结果显示，5次吸光度值的相对标准偏差（RSD）为0.53%，表明该方法有良好精密度。稳定性试验发现，5次吸光度值的RSD为1.36%，表明在8 h内测定供试品基本稳定。重复性试验中5次吸光度值的RSD为1.73%；回收率试验得出平均回收率97.59%，RSD=1.55%，表明该方法有良好重现性。
2.2 山牡荆总黄酮提取工艺优化
2.2.1 正交试验。极差分析表明（），影响山牡荆总黄酮的提取主次因素依次为B>A>C>D，即乙醇用量>乙醇浓度>提取次数>提取时间；方差分析（）显示，乙醇浓度、乙醇用量对结果影响具有极显著性的意义，提取次数对试验结果影响有显著意义。正交设计结果（）显示，提取工艺A1B2C3D2为最佳，但D因素影响小，且3个水平相差不大，为了节省能源，选用D1。因此，最佳工艺确定为70%乙醇12倍量加热回流提取3次，每次1 h。
2.2.2 工艺验证试验。采用筛选后得到的最佳工艺，即A1B2C3D1提取3次，进行了验证试验，按“1.3.3”方法测吸光度，计算总黄酮的含量。结果发现，3批山牡荆总黄酮的含量分别为40.32、39.02、39.56 mg/g，相对标准偏差RSD=1.65%（n=3），表明该工艺路线是稳定可靠的。
3 结论
笔者曾进行了山牡荆药材粒度、提取时间、乙醇用量、乙醇浓度、提取次数单因素的筛选试验，结果显示山牡荆粒度对提取效率的影响不大，因此选择对提取效率有较大影响的乙醇浓度、提取时间、提取次数、乙醇用量为考察因素，进行正交试验，优选其最佳提取工艺条件。经正交设计结果分析及方差分析，发现影响山牡荆总黄酮提取主次因素依次为乙醇用量>乙醇浓度>提取次数>提取时间，经综合各种因素后，选定A1B2C3D1为山牡荆总黄酮的最佳提取方案，即70%浓度12倍量乙醇经加热回流提取3次，每次1 h，按此条件提取，总黄酮含量较高。并按照最佳提取条件进行了验证试验，结果表明该提取工艺方法简单、高效、稳定。
参考文献
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