7株拮抗细菌对蝴蝶兰叶基腐病菌的抑菌作用及其小区防效评价
摘 要 以7株拮抗细菌对蝴蝶兰叶基腐病菌进行室内抑菌及小区防病试验。室内平板对峙法结果表明：以兰花内生枯草杆菌FJAT-9986的拮抗作用最强，其抑菌率为61.90%；JK-2抑菌率为50.44%；FJAT-8769的拮抗作用最弱，抑制率仅为34.09%。抑菌圈法复筛测定结果表明，菌株JK-2对蝴蝶兰叶基腐病菌的抑制作用最强，其抑菌圈直径为22.42 mm。拮抗细菌对病原菌孢子萌发实验结果表明，稀释50倍后，JK-2显示出强的抑制病原菌孢子的萌发作用，对蝴蝶兰叶基腐病的田间防效为76.7%，表明JK-2可作为田间防治的菌株。
关键词 拮抗细菌；蝴蝶兰叶基腐病菌；抑菌作用；防效评价
中图分类号 S432.4 文献标识码 A
Inhibition of Seven Strains of Antagonistic Bacteria Against the Pathogen of Butterfly Orchid Leaf Based Rot
XU Wenjiang1， LI Jinyu1， LIN Zhikai1， HUANG Yuhuan1， LIN Qinghong1， GE Cibin2
1 Fujian Institute of Subtropical Botany， Xiamen， Fujian 361006， China
2 Agro-bio Resource Research Institut， Fujian Academy of Agricultural Science， Fuzhou， Fujian 350000， China
Abstract Seven strains of antagonistic bacteria were studied for biocontrol effect and inhition against the pathogen of butterfly orchid leaf based rot. The result of pairing culture showed that Bacillus subtilis of orchids" antagonism with a bacteriostatic rate 61.90% is the strongest， followed by JK-2（bacteriostatic rate 50.44%）and FJAT-8769（inhibition rate 34.09%）based on bacteriostatic ring method complex screen test. The inhibitory effect of JK-2 aim at butterfly orchid leaf based rot germs was the strongest， and the inhibition zone diameter was 22.42 mm. The antagonistic bacteria for pathogen spore germination test after dilution 50 times revealed JK-2 showed stronger inhibitory pathogen spore germination effect. Field experiments showed JK-2 exhibited a inhibition rate 76.7%. In conclusion JK-2 can be used as a test strain in field to control butterfly orchid leaf based rot disease.
Key words Antagonistic bacteria；Fusarium solani；Inhibition；Control efficiency
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.026
蝴蝶兰（Phalaenopsis）为兰科蝴蝶兰属的美丽草本花卉，其姿态优美、花色艳丽，形似蝴蝶，开花期长，在热带兰中素有“兰花皇后”的美称，深受世界各国人民的喜爱。近几年，蝴蝶兰在国内的年宵花卉市场上无比畅销，尽管种植数量迅速增加，但高质量的蝴蝶兰仍能销售一空。然而，在蝴蝶兰的栽培中，常受蝴蝶兰叶基腐病的危害，最下部叶基受侵染后，产生黑色小点、水渍状、形态半圆形或不规则病斑，后期叶片失水黄化、红化，叶基部出现灰白色菌核，红褐色的子座组织，然后病斑扩展至整个叶基部，叶片断裂、脱落，继续侵染上一片叶基部，直至整株枯死[1]。发病率轻者为5%，重者达20%左右，严重危害蝴蝶兰的人工栽培。
目前，蝴蝶兰产区都是以化学防治为主，造成环境污染，病原菌抗药性。Thangavelu等[2]报道荧光假单胞杆菌（P. fluorescens）和枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）对香蕉枯萎病的防治效果可达41%。曹理想等[3]发现玫瑰浅灰链霉菌（Streptomyces roseogriseolus）对香蕉枯萎病有一定的拮抗作用。肖爱萍等[4]从果园土壤中分离到1株对香蕉枯萎病有显著抑制作用的假单胞杆菌。至今国内外还没有蝴蝶兰叶基腐病生物防治方面的报道，本试验采用铜绿假单胞杆菌FJAT-346、短短芽胞杆菌JK-2、芽胞杆菌FJAT-8789、FJAT-8769、FJAT-8756、FJAT-8767、兰花内生枯草芽胞杆菌FJAT-9986等菌株对蝴蝶兰叶基腐病菌的室内抑制活性和田间小区防效，以期为生产上该病害的有效防控提供基础。
1 材料与方法
1.1 材料
病原菌：蝴蝶兰叶基腐病菌（Fusarium solani）[1]由福建省亚热带植物研究所自行分离、纯化、回接获得。
供试细菌：铜绿假单胞杆菌FJAT-346、短短芽胞杆菌JK-2、芽胞杆菌FJAT-8789、FJAT-8769、FJAT-8756、FJAT-8767、兰花内生枯草芽胞杆菌FJAT-9986等菌株由福建省农业科学院农业生物资源研究所农业微生物研究中心提供。
供试培养基：PDA固体培养基、NA固体培养基、NB液体培养基。
蝴蝶兰品种：甜新由厦门国际航空港花卉科技有限公司蝴蝶兰生产基地提供。
1.2 方法
1.2.1 平板对峙法初筛对病原菌具有拮抗作用的拮抗菌 采用PDA平板对峙法，在PDA培养基平板中间接入直径6 mm生长旺盛的病原菌菌饼，同时在距离菌饼中间2.5 cm处的PDA平板的一侧或相对称的两侧，用接种环划直线接种活化后的各细菌菌株，放置于28 ℃培养箱内培养；以不接细菌的平板为对照，每处理重复3次；接种3、5 d后，观察病原菌菌落的生长情况，测量菌落半径，并计算各细菌对病原菌的抑制率[2-8]。
抑菌率/%=（对照菌落半径-处理菌落半径）/对照菌落半径×100%
1.2.2 抑菌圈法复筛对病原菌具有拮抗作用的拮抗菌 收集对峙培养法中筛选出的细菌菌株，用NB液体培养基（瓶装量30 mL/250 mL三角瓶），30 ℃、200 r/min下振荡培养；48 h后收集培养液，8 000 r/min离心5 min，收集上清液，用细菌过滤器过滤除菌，得无菌滤液，测得OD值为0.87，菌体数为2.4×109 cfu/mL，备用。
病原菌孢子悬液的制备：PDA培养基平板接种病原菌，28 ℃下培养7 d后，平板上长满棉花状的病原菌菌落，向平板内加入适量（约10 mL）无菌水，用无菌涂布棒刮菌落表面，使菌丝及孢子悬浮在无菌水中；收集孢子及菌丝悬液，用无菌纱布滤去菌丝体，得孢子悬液（浓度需在1.0×108 cfu/mL），备用。
吸取镰刀菌孢子悬液0.5 mL，加入到熔化并冷却到50 ℃左右、呈熔融态、0.7%琼脂的6 mL PDA培养基内，混合均匀后，作为上层培养基，倒入预先已凝固的PDA平板上。
待上层培养基凝固后，用直径0.6 cm的打孔器在每块平板上打4个孔，用移液枪分别向每个孔内加入不同的细菌培养液无菌滤液各100 μL，以无菌水做对照，然后将平板放置在26 ℃培养箱培养72 h后，采用十字法测量抑菌圈的直径，比较各菌株抑制病原菌能力的大小[2-8]。
1.2.3 拮抗菌培养液对病原菌孢子萌发的抑制作用 对抑菌圈试验筛选出的拮抗菌，按1.2.2的方法制备无菌滤液，并分别用无菌水配制成5、25倍的稀释液。按1.2.2的方法制备病原菌孢子悬液，并用无菌水稀释至1.0×106 cfu/mL；取病原菌孢子悬液与不同浓度的拮抗菌培养液各1 mL，加入到无菌试管（18 mm×180 mm）中，混匀，置28 ℃、100 r/min下振荡培养12 h，以无菌水和相应稀释倍数的NB液体培养基为对照。每处理重复3次。每重复随机镜检10个视野，镜检的小型孢子数为200以上，观察孢子的萌发状况（以萌发的芽管超过孢子长径的一半或与短径等长视为萌发），统计孢子萌发数与未萌发数，并计算各拮抗菌培养液最终稀释成2、10、50倍条件下的孢子萌发抑制率。
1.2.4 田间小区试验 田间小区在福建省亚热带植物研究所温室试验地进行，选择健康无病中苗期的蝴蝶兰植株200株，每小区66～67株，重复3次，随机排列。JK-2菌株OD值为0.87，稀释100倍，每株100 mL，10 d施1次，共施6次，以清水为对照，于最后一次施药后30 d进行调查，统计发病株数，并计算发病率和防治效果[9]。
2 结果与分析
2.1 平板对峙法初筛的结果
由表1和图1可知，通过平板对峙培养，7株细菌菌株拮抗作用测定结果表明，在处理2 d后，JK-2等7株即表现出对病原菌的拮抗作用，其中以兰花内生枯草杆菌FJAT-9986的拮抗作用最强，对病原菌的抑制率达36.39%；菌株FJAT-8781的拮抗作用其次，抑制率为20.49%。处理5 d后，处理组病原菌的生长进一步受到抑制，对照组病原菌生长正常，使得各拮抗细菌的抑制率上升；兰花内生枯草杆菌FJAT-9986仍表现出最强的拮抗作用，抑制率为61.90；JK-2、芽胞杆菌FJAT-8781、FJAT346、FJAT-8756、FJAT-8767等菌株对蝴蝶兰叶基腐病菌的拮抗作用也较强，抑制率均在46%以上；菌株FJAT-8769的拮抗作用最弱，抑制率仅为34.09%。
2.2 抑菌圈法复筛的结果
用抑菌圈法对平板对峙试验筛选出的拮抗细菌进行复筛，结果见表2和图2。菌株JK-2对蝴蝶兰叶基腐病菌的抑制作用最强，处理3 d后的抑菌圈直径为22.42 mm，显著大于其它6个菌株的抑菌圈直径；芽胞杆菌FJAT-8781、兰花内生枯草杆菌、FJAT-346对病原菌的抑制作用也较强，其抑菌圈直径分别为17.73、14.19、10.57 mm；菌株FJAT-8756、FJAT-8767、FJAT-8769在病原菌平板上未形成抑菌圈，因此，对病原菌未表现出抑制作用。
2.3 拮抗细菌培养液对病原菌孢子萌发的抑制作用
由表3可知，菌株JK-2和FJAT-8781对病原菌孢子萌发的抑制作用最强，这2个菌株培养液2、10、50倍稀释液对病原菌孢子萌发均有抑制作用，其中以2倍稀释液处理组的孢子萌发率最低，50倍稀释液处理组的孢子萌发率最高。与相应稀释倍数的NB培养液处理组相比，菌株JK-2和FJAT-8781培养液2、10、50倍稀释液处理组中，其对病原菌孢子萌发的抑制率分别为99.94%、96.57%、92.30%和99.28%、95.28%、35.23%。比较菌株JK-2和FJAT-8781对病原菌孢子萌发的抑制作用，结果表明，在稀释2、10倍的条件下，这2个菌株培养液抑制率间的差异不显著；而稀释50倍后，JK-2的抑制率显著大于FJAT-8781，显示出强的抑制病原菌孢子萌发的作用。
2.4 JK-2对蝴蝶兰叶基腐病的田间防治效果
田间小区试验在本所的试验地进行，在处理30 d后，清水对照区的发病率为60%，JK-2处理的发病率为14%，JK-2的防治效果为76.7%。
3 讨论与结论
平板对峙法结果表明，以兰花内生枯草杆菌FJAT-9986的拮抗作用最强，抑菌率为61.90%；JK-2抑菌率为50.44%；FJAT-8769的拮抗作用最弱，抑制率仅为34.09%。
抑菌圈法结果表明，菌株JK-2对蝴蝶兰叶基腐病原菌菌丝的抑制作用最强，其抑菌圈直径为22.42 mm，芽胞杆菌FJAT-8781次之，处理3 d后的抑菌圈直径为17.73 mm，菌株FJAT-8756、FJAT-8767、FJAT-8769未形成抑菌圈，因此，对病原菌未表现出抑制作用。
拮抗细菌对病原菌孢子萌发结果表明，菌株JK-2和FJAT-8781稀释2、10倍，抑制率间的差异不显著；而稀释50倍后，JK-2显示出强的抑制病原菌孢子萌发作用，可作为田间防治蝴蝶兰叶基腐病的菌株。
JK-2菌株田间防治蝴蝶兰叶基腐病，其防治效果为76.7%。
郝晓娟等[9]认为短短芽胞杆菌JK-2菌株对番茄枯萎病的拮抗作用表现为造成枯萎病菌菌丝消解、产生泡状物、破坏生长点。但本平板对峙法及抑菌圈法结果显示短短芽胞杆菌JK-2菌株对蝴蝶兰叶基腐病病原菌菌丝、孢子有有很强抑制效果，但其对不同的病菌是否产生不同拮抗反应，还有待进一步研究。
参考文献
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